ATP含量試劑盒(酶法)

ATP含量試劑盒(酶法)

ATP含量試劑盒(酶法)

本試劑盒僅供科研使用 1 ATP 含量測(cè)定試劑盒說明書 （貨號(hào)：WS7580F 分光法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 三磷酸腺苷（ATP）是生物體內(nèi)能量轉(zhuǎn)換最基本的載體,是生物體內(nèi)最直接的能量來源， 測(cè)定 ATP 含量并且計(jì)算能荷，能夠反映能量代謝狀態(tài)。 三磷酸腺苷（ATP）在己糖激酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫酶混合酶的作用下，使 ATP 水解 并伴隨著 NADPH 的生成，通過檢測(cè) 340nm 下 NADPH 的增加量，進(jìn)而計(jì)算得到 ATP 的 含量。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下或離心，使粉劑落 入底部，再加 1.1mL 蒸餾水備用。 試劑二 粉劑×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下或離心，使粉劑落 入底部，再加 1.1mL 蒸餾水備用。 試劑三 33mL 液體×1 瓶 4℃保存 試劑四 粉劑×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下或離心，使粉劑落 入底部，再加 1.1mL 蒸餾水備用。 三、所需的儀器和用品： 紫外分光光度計(jì)、1mL 石英比色皿（光徑 1cm）、恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液槍、研缽 和蒸餾水。 四、ATP 含量檢測(cè)： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織加入研缽中，加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心 10min，取上清液，置冰上待測(cè)。 【注】：也可以按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取 ② 細(xì)菌/真菌樣本： 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心棄上清；取 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液； 冰浴超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3S，間隔 10S，重復(fù) 30 次）；12000rpm，4℃離心 10min，取上清液，置冰上待測(cè)。 【注】：也可按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取 ③ 液體樣本：澄清的液體直接檢測(cè)；若渾濁則離心后取上清檢測(cè)。 ④ 高蛋白含量樣本： ④-1：稱取約 0.1g 組織加入研缽中，加入 1mL 蒸餾水，進(jìn)行勻漿，轉(zhuǎn)至 EP 管中，于 95℃水浴中煮 5min，取出冷卻至室溫后于 12000rpm，室溫離心 10min，上清液待測(cè)。 ④-2：或稱取約 0.1g 組織加入研缽中，加入 0.5mL 高氯酸（0.5M），進(jìn)行冰浴勻漿， 8000rpm，4℃離心 10min，取全部上清至另一 EP 管中，再加入與上步所取上清液等體 積的 KOH 或 NaOH（0.5M）混勻，使整個(gè)液體 PH 近中性，若澄清直接檢測(cè)，若渾濁 則 8000rpm，4℃離心 5min 后取上清液測(cè)定，此時(shí)整個(gè)上清液體積記為 V3。本試劑盒僅供科研使用 2 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 紫外分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 340nm，蒸餾水調(diào)零。 ② 在 1mL 石英比色皿（光徑 1cm）中依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 樣本 40 試劑一 20 試劑二 20 試劑三 600 混勻，室溫（25℃）下，5min后于340nm 處讀取A1值。 試劑四 20 混勻，室溫（25℃）下，反應(yīng)15min于 340nm處讀取A2值，ΔA=A2-A1。 【注】若ΔA 差值在零附近，可增加樣本量 V1（如 100μL，則試劑三相應(yīng)減少）。 則改變后的 V1 需代入公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、按樣本鮮重計(jì)算： ATP 含量(μmol/g 鮮重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×106]÷(W×V1÷V)=2.78×ΔA÷W 2、按細(xì)菌/細(xì)胞密度計(jì)算： ATP 含量(μmol/104 cell)=[ΔA÷(ε×d)×V2×106]÷(500×V1÷V)=0.006×ΔA 3、液體中 ATP 含量計(jì)算： ATP 含量(μmol/mL)=[ΔA÷(ε×d)×V2×106]÷V1=2.78×ΔA 4、高蛋白樣本中 ATP 含量計(jì)算： ATP 含量(μmol/g 鮮重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×106]÷(W×V1÷V)=2.78×ΔA÷W ATP 含量(μmol/g 鮮重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×106]÷(W×V1÷V3)=2.78×ΔA÷V3÷W ε---NADPH的摩爾吸光系數(shù)為6.3×103L/mol/cm； d---光徑距離，1cm； V---提取液體積，1mL； V1---樣本體積，40μL=0.04mL； V2---反應(yīng)總體積，700μL=7×10-4L； ATP分子量---551.14； W---樣本質(zhì)量，g。