離子結(jié)合型果膠(ISP)含量試劑盒,微板法

離子結(jié)合型果膠(ISP)含量試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 離子結(jié)合型果膠(ISP)含量試劑盒說明書 （貨號(hào)：WS5070W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 果膠是構(gòu)成細(xì)胞初生壁和中膠層的主要成分，主要由原果膠、果膠酸甲酯和果膠酸等形 式廣泛分布于植物果實(shí)、根莖和葉中。果膠間以 Ca2+、Mg2+、氫鍵、糖苷鍵、酯鍵等方 式與其他物質(zhì)交聯(lián)，通過特異的提取方式可以提取得到離子結(jié)合型果膠（ISP）和共價(jià)結(jié) 合果膠（CSP）。 本試劑盒用帶有螯合劑的酸溶液特異提取離子結(jié)合型果膠（ISP），采用硫酸-咔唑比 色法測(cè)定果膠含量。果膠水解為半乳糖醛酸，在硫酸溶液中與咔唑進(jìn)行縮合反應(yīng)，生成紫 紅色物質(zhì)，經(jīng)光譜掃描該物質(zhì)在 530nm 處有吸收峰，顏色深淺與果膠含量成正比，進(jìn) 而得離子結(jié)合型果膠含量。 二、測(cè)試盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 A 液體 120 mL×1 瓶 4℃保存 提取液 B 液體 120 mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 1.5mL×1 支 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、水浴鍋、可調(diào)式移液器、乙醇、濃硫酸、研缽。 四、離子結(jié)合型果膠(ISP)含量測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 取 0.1g 組織（烘干且過篩后的粉末組織可取 0.02g），加 1.5mL 的 80%乙醇，研磨勻 漿，85℃水浴 10min，取出流水冷卻后，8000rpm，25℃10min，棄上清，留沉淀（盡 量保留沉淀）。 ② 向沉淀中加入 1mL 的 80%乙醇震蕩混勻 2min，85℃水浴 10min，取出流水冷卻后， 8000rpm，25℃10min，棄上清，留沉淀（盡量保留沉淀）。 ③ 加入 1mL 的提取液 A，90℃水浴 15min（間隔 3min 晃動(dòng)一次），8000rpm，室溫（25℃） 離心 10min，棄上清，留沉淀，向沉淀中加入 1mL 丙酮振蕩混勻，8000rpm，室溫 （25℃）離心 10min，棄上清，留沉淀，（注:若色素仍很多，繼續(xù)用丙酮提取 1-2 次）， 打開 EP 管置于 90℃孵育 20min，使沉淀干燥。 ④ 向沉淀中加入 1mL 提取液 B，室溫（25℃）震蕩提取 1 小時(shí)后，8000rpm，25℃離 心 10min，上清液待測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長為 525nm。 ② 可取兩個(gè)樣本做適當(dāng)梯度的稀釋（如 4 倍，即 1 份上清液+3 份蒸餾水），確定 適合本次實(shí)驗(yàn)的稀釋倍數(shù) D。 ③ 在 EP 管中依次加入：本試劑盒僅供科研使用 2 試劑名稱 （µL） 測(cè)定管 空白管 （僅做一次） 樣本 70 蒸餾水 70 濃硫酸 420 420 可用封口膜纏緊，85℃水浴 15min 后， 流水冷卻至室溫。 試劑一 14 14 混勻，室溫（25℃）暗處反應(yīng) 30min（間隔 10min 混勻一次），立即取出 200µL 于 96 孔中，于 530nm 處讀取吸光值 A，△A=A 測(cè)定-A 空白。 【注】：1、濃硫酸必須是分析純級(jí)別，且不能長期開口放置，否則影響顯色結(jié)果。另外濃硫酸具有 強(qiáng)腐蝕性，操作時(shí)需特別注意，85℃加熱取出后冷卻再打開蓋子，以防液體飛濺燒傷。 2、顯色反應(yīng)必須在暗處反應(yīng)，否則顏色很快消失或者變淡，影響吸光值。 3、若 A 測(cè)定管值大于 1.8，可用蒸餾水稀釋樣本即待檢測(cè)上清液，則稀釋倍數(shù) D 需代入公 式計(jì)算；或若 A 值再零附近可增加樣本取樣質(zhì)量 W。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y = 1.8749x -0.0018，x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y 是△A。 2、離子結(jié)合型果膠(mg /g 重量)= [(ΔA +0.0018) ÷1.8749×V1]÷ (W×V1÷V)×D =0.53×(ΔA +0.0018)÷W×D W---樣本重量，g； V---加入提取液體積，1mL； V1---加入樣本體積，0.07mL； D---稀釋倍數(shù)。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（0.5mg/mL）：臨用前向標(biāo)準(zhǔn)品中加入 2mL 蒸餾水（現(xiàn)配現(xiàn)用）。 2 把母液用蒸餾水稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5. mg/mL。 也可根據(jù)實(shí)際樣本來調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)測(cè)定管的加樣表操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

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