乙醇酸氧化酶(GO)試劑盒,微板法

乙醇酸氧化酶(GO)試劑盒,微板法

乙醇酸氧化酶(GO)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 乙醇酸氧化酶活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū) （貨號(hào)：WS0160W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 乙醇酸氧化酶（GO，EC 1.3.3.1）是植物光呼吸過(guò)程中的關(guān)鍵酶，它催化乙醇酸氧化生 成乙醛酸，即植物光呼吸的底物。乙醇酸氧化酶與植物光呼吸、生長(zhǎng)發(fā)育、礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)及感 病等密切相關(guān)。 乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化成乙醛酸，生成的乙醛酸與苯肼反應(yīng)生成乙醛酸苯腙。乙 醛酸苯腙 324nm 處有吸收峰，通過(guò)測(cè)定乙醛酸苯腙的增加量，即可得出乙醇酸氧化 酶的酶活大小。 二、測(cè)試盒組成和配制： 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板（UV 板）、低溫離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、乙醇酸氧化酶(GO)活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： 稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿。4℃×12000rpm 離心 10min，取上 清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 324nm。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃）。 ③ 為了減少操作誤差，建議使用排槍。 ④ 依次在 96 孔板中加入： 【注】1. 加完試劑二即啟動(dòng)反應(yīng)，所以試劑二加完混勻后立即檢測(cè)，若 A2 值大于 1.5，可對(duì)樣本進(jìn)行稀 釋?zhuān)♂尡稊?shù)需代入公式重新計(jì)算。 2. 若ΔA小于0.005，可增大樣本量V1（如增至20μL，提取液相應(yīng)減少），或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間T（如 增至10min或更長(zhǎng)），則改變后的V1和反應(yīng)時(shí)間T需代入公式重新計(jì)算。 試劑名稱(chēng) 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 120mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 瓶 -20℃保存 臨用前甩幾下或離心，使粉體落入底 部，再加 2.6mL 蒸餾水混勻備用 試劑二 粉劑 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下或離心，使液體落入底 部，再加 2.5mL 蒸餾水混勻備用 試劑名稱(chēng)（μL） 測(cè)定管 樣本 10 試劑一 20 提取液 150 試劑二 20 混勻，立即于 324nm 處讀取 A1 值，室溫（25℃）反應(yīng) 3min 后讀取 A2 值。ΔA=A2-A1。本試劑盒僅供科研使用 2 五、結(jié)果計(jì)算： 1、按質(zhì)量計(jì)算： 酶活定義：每克組織每分鐘催化生成 1nmol 的乙醛酸苯腙定義為一個(gè)酶活單位。 GO(nmol/g/min)=[ΔA÷(ε×d)×V2×103]÷(V1÷V×W)÷T×D=784.3×ΔA÷W×D 2、按蛋白濃度計(jì)算： 酶活定義：每毫克蛋白每分鐘催化生成 1nmol 的乙醛酸苯腙定義為一個(gè)酶活單位。 GO(nmol/mg/min)=[ΔA÷(ε×d)×V2×103]÷(V1×Cpr)÷T×D=784.3×ΔA÷Cpr×D ε---乙醛酸苯腙的摩爾吸光系數(shù)為17.0mL/μmol/cm； d---光徑距離，0.5cm； V2---反應(yīng)總體積，0.2mL； V1---樣本上樣量，0.01mL； V---提取液體積，1mL； W---樣本鮮質(zhì)量，g； T---反應(yīng)時(shí)間，3min； D---稀釋倍數(shù)，若未稀釋則 D 值為 1。