糖原合成酶(GCS)試劑盒,微板法

糖原合成酶(GCS)試劑盒,微板法

糖原合成酶(GCS)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 糖原合酶（Glycogen synthase，GCS）試劑盒說明書 （貨號：WS2650W 微板法 96 樣） 一、產品簡介： 糖原合酶（GCS，EC 2.4.1.11）將 UDP-G 糖基加到葡萄糖殘基上，以α-1，4-糖苷鍵相 連延長糖鏈，GCS 是糖原合成的限速酶，對糖代謝和血糖穩態的維持具有重要作用。 GCS催化UDPG和葡萄糖殘基生成糖原和UDP，丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶的逐一作用 下，使NADH氧化為NAD+，通過檢測NADH在340nm處的下降量來計算GCS酶活大小。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再 加 1.2mL 蒸餾水充分溶解備用。 試劑二 粉劑 mg×4 支 -20℃保存 每支用前甩幾下使試劑落入底部， 再加 0.3mL 的蒸餾水溶解備用。用 不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止 反復凍融，三天內用完。 試劑三 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再 加 1.2mL 蒸餾水充分溶解備用。 試劑四 液體 15mL×1 瓶 4℃保存 試劑五 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再 加 1.2mL 蒸餾水充分溶解備用。 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、臺式離心機、可調式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、糖原合酶（GCS）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進行冰浴勻漿。12000rpm 4℃離心 15min，取上 清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取 ② 細胞樣本： 先收集細胞到離心管內，離心后棄上清；取 500 萬細胞加入 1mL 提取液；超聲波破 碎細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；4oC 約 12,000rpm 離心 10min，取上清作為待測樣品。 【注】：若增加樣本量，可按照細菌/細胞數量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進行提取。 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min 以上，設置溫度 30℃,調節波長至 340nm。 ② 試劑放在 30℃水浴 5min； ③ 在 96 孔板中依次加入：本試劑盒僅供科研使用 2 試劑名稱（μL） 測定管 樣本 20 試劑一 10 試劑二 10 試劑三 10 試劑四 140 混勻，30℃下孵育 5min。 試劑五 10 混勻，30℃下，2min 時于 340nm 處讀取吸光 值 A1，22min 時讀取 A2，△A=A1-A2。 【注】：1.若ΔA 過小，可以延長反應時間（如：32min 或更長）再讀取 A2，或增加樣本加樣量 V1（如 增至 40μL，則試劑四相應減小），重新調整的反應時間 T 和 V1 需代入計算公式重新計算。 2.若 A2 值小于 0.45，則需縮短反應時間 T（如減至 12min）再讀取 A2 或減少樣本量 V1（如減 至 10μL，則試劑四相應增加），重新調整的反應時間 T 和 V1 需代入計算公式重新計算。 五、結果計算： 1、按樣本蛋白濃度計算 單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1nmol NADH 定義為一個酶活力單位。 GCS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA÷（ε×d）×V2×109]÷(V1×Cpr) ÷T=160.8×ΔA÷Cpr 2、按樣本鮮重計算 單位定義：每克組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。 GCS（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA÷（ε×d）×V2×109]÷(W×V1÷V)÷T=160.8×ΔA÷W 3、按細胞密度計算 單位定義：每 1 萬個細胞每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。 GCS（nmol/min/104 cell）＝[ΔA÷（ε×d）×V2×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.323×ΔA ε---NADH 摩爾消光系數，6.22×103 L/mol/cm； d---96 孔板光徑，0.5cm； V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.02mL； V2---反應體系總體積，2×10-4 L； T---反應時間，20 min； W---樣本質量，g； 500---細胞數量； Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。