細胞壁不溶性酸性轉化酶(B-AI)試劑盒微板法

細胞壁不溶性酸性轉化酶(B-AI)試劑盒微板法

細胞壁不溶性酸性轉化酶(B-AI)試劑盒微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 細胞壁不溶性酸性轉化酶（B-AI）試劑盒說明書 （貨號：WS8150W 微板法 48 樣） 一、產品簡介： 蔗糖酶即蔗糖轉化酶（Invertase，E.C.3.2.1.26）在蔗糖代謝中催化蔗糖分解為果糖和葡萄糖，是高等 植物蔗糖代謝關鍵酶之一。根據最適 PH 值，蔗糖轉化酶分為酸性轉化酶（AI）和中性轉化酶（NI）兩 種類型，許多報道均將中性轉化酶同堿性轉化酶看作一種轉化酶。 AI 的最適 pH 為 3.0～5.0，AI 分為可溶性 AI(S-AI)和細胞壁不溶性 AI（B-AI：cell-wall binding acid invertase）兩種類型，前者分布在液泡中或細胞自由空間，后者存在于細胞間隙并結合在細胞壁上。B-AI 主要參與韌皮部質外體卸載時蔗糖的分解，以維持庫源之間蔗糖的濃度。 B-AI 催化蔗糖降解產生還原糖，進一步與 3,5－二硝基水楊酸反應，生成棕紅色氨基化合物，經光譜 掃描在 540nm 有特征光吸收，在一定范圍內 540nm 光吸收增加速率與 B-AI 活性成正比。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 A 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 提取液 B 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑×1 瓶 4℃保存 用前加入 7.5mL 試劑一充分溶解 備用；用不完的試劑 4℃保存; 試劑三 液體 10mL×1 瓶 4℃保存 標準品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、低溫離心機、水浴鍋、移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、細胞壁不溶性酸性轉化酶（B-AI）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 按照組織質量（g）：提取液 A 體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液 A），進行冰浴勻漿。12000rpm 4℃離心 10min，棄上清，留沉淀。 ② 沉淀中加入 1mL 蒸餾水，震蕩混勻，12000rpm4℃離心 10min，棄上清，留沉淀。 ③ 沉淀中加入 1mL 提取液 B 充分混勻，4℃浸提過夜，12000 rpm 4℃離心 20min，取 上清置冰上待測。 2、上機檢測： 1 酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 540nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 40 40 試劑一 100 200 試劑二 100 混勻， 37℃準確水浴 20min 后，95℃水浴 10min（用封口膜纏緊， 以防止水分散失），流水冷卻后充分混勻（以保證濃度不變） 試劑三 100 100 混勻，95℃水浴 10min（用封口膜纏緊，以防止水分散失），流水冷本試劑盒僅供科研使用 2 卻后充分混勻，吸取 200μL 轉移至 96 孔板中，540nm 處讀取吸光值 A，ΔA=A 測定-A 對照（每個測定管需設一個對照管）。 【注】：1.若吸光值大于 1.5，可以用蒸餾水稀釋樣本后測定，計算公式中乘以相應稀釋倍數 D。 2.若ΔA 值在零附近徘徊，可增加樣本加樣體積 V1（如增至 80μL，則試劑一相應減少），或延 長 37℃水浴時間（如增至 40min 或更長），則相應的 V1 和 T 需代入公式重新計算。 五、結果計算： 1、標準曲線方程為 y = 0.007x - 0.0234；x 為標準品質量（μg），y 為ΔA。 2、按蛋白濃度計算： 單位定義：37℃每毫克蛋白每分鐘產生 1μg 還原糖定義為一個酶活性單位。 細胞壁不溶性酸性轉化酶(B-AI)(μg/min/mg prot)=[(ΔA+0.0234)÷0.007]÷(V1×Cpr)÷T×D =178.6×(ΔA+0.0234)÷Cpr×D 3、按鮮重計算： 單位定義：37℃每克組織每分鐘產生 1μg 還原糖定義為一個酶活性單位。 細胞壁不溶性酸性轉化酶(B-AI)(μg/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0234)÷0.007]÷(W×V1÷V)÷T×D =178.6×(ΔA+0.0234)÷W×D V---加入提取液體積，1mL； V1---加入反應體系中樣本體積，0.04mL； T---反應時間，20min； W---樣本鮮重，g。 D---稀釋倍數，未稀釋即為 1； Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒； 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（5mg/mL）：向標準品 EP 管里面加入 1mL 蒸餾水（母液需在兩天 內用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個濃度梯度的標準品：0, 1, 2, 3, 4, 5. mg/mL。也可根據實際樣本來 調整標準品濃度。 3 按照：40μL 標準品+200μL 試劑一+100μL 試劑三，依次加樣操作，95℃水浴 10min， 冷卻后，取 200μL 至 96 孔板中，540nm 下測定，根據結果即可制作標準曲線。