內切-β1,4-葡聚糖酶/纖維素酶試劑盒微板法

內切-β1,4-葡聚糖酶/纖維素酶試劑盒微板法

內切-β1,4-葡聚糖酶/纖維素酶試劑盒微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 內切-β-1,4-葡聚糖酶/纖維素酶試劑盒說明書 （貨號：WS3350W 微板法 96 樣） 一、產品簡介： 內切-β-1,4-葡聚糖酶（EC3.2.1.4）存在于細菌、真菌和動物體內，是纖維素酶系的組份 之一，這類酶隨機水解β-1,4-糖苷鍵，將無定形長鏈纖維素分子截短，將其分解成葡萄糖、 纖維二糖、纖維三糖等各種類型的還原糖，在堿性條件下，產生的還原糖能與3,5-二硝基 水楊酸反應生成棕紅色物質，該物質在540nm下有吸收峰，即可得出內切-β-1,4-葡聚 糖酶的酶活性大小。 二、試劑盒組分與配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 110mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 32mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑×1 瓶 4℃保存 臨用前加 16mL 試劑一，80℃水 浴，攪拌至溶解，仍 4℃保存。 試劑三 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 標準品 粉體 mg×1 支 4℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、水浴鍋、離心機、可調式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、內切-β-1,4-葡聚糖酶/纖維素酶活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織：稱取約 0.2g 組織（水分充足的樣本可取 1g），加入 1mL 經預冷的 95%乙醇冰浴 勻漿，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清，留沉淀，向沉淀中加入經 預冷的 80%乙醇混勻，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 5min；棄上清，留沉淀。 再向沉淀中加入 1mL 經預冷提取液，渦旋混勻，4℃放置 10min；12000rpm，4℃離心 10min；留上清，棄沉淀。上清液置冰上待測。 ② 細菌/培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；取約 500 萬細菌或細 胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間 隔 10s，重復 30 次）；12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細菌或細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為 500：1 比例進行提取。 ③ 液體樣本：若是澄清液體，直接檢測，若液體樣本渾濁，需 4℃×12000rpm，離心 10min， 取上清液檢測。 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 540nm。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃），在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 50 50 試劑一 150 試劑二 150 37℃孵育 60min 試劑三 150 150本試劑盒僅供科研使用 2 混勻，95℃水浴 5min，取出后用自來水或冰水冷卻至室溫， 取 200μL 澄清液體于 96 孔板中，在 540nm 處讀取吸光值 A，ΔA=A 測定管-A 對照管（每個樣本做一個對照管）。 【注】若ΔA 在零附近如低于 0.005，可增加樣本取樣質量 W 或增加樣本加樣體積 V1（如增至 80μL， 則試劑三相應減少），則改變后的 W 和 V1 需代入計算公式重新計算。 五、結果計算： 1、標準曲線方程為 y = 0.0132x - 0.0545；x 為標準品質量（μg），y 為ΔA。 2、按照蛋白濃度計算 單位定義：每毫克組織蛋白每小時催化產生 1μg 還原糖定義為一個酶活力單位。 內切-β-1,4-葡聚糖酶/纖維素酶活力(μg/h/mg prot)=[(ΔA+0.0545)÷0.0132]÷(Cpr×V1) ÷T =1515.2×(ΔA+0.0545) ÷Cpr 3、按樣本鮮重計算 單位定義：每克組織每小時催化產生 1μg 還原糖定義為一個酶活力單位。 內切-β-1,4-葡聚糖酶/纖維素酶活力(μg/h/g 鮮重)=[(ΔA+0.0545)÷0.0132]÷(W×V1÷V) ÷T =1515.2×(ΔA+0.0545)÷W 4、按細菌/細胞密度計算 單位定義：每 1 萬個細菌或細胞每小時催化產生 1μg 還原糖定義為一個酶活力單位。 內切-β-1,4-葡聚糖酶/纖維素酶活力(μg/h/104 cell)=[(ΔA+0.0545)÷0.0132]÷(500×V1÷V) ÷T =3×(ΔA+0.0545) 5、按液體體積計算 單位定義：每毫升液體每小時催化產生 1μg 還原糖定義為一個酶活力單位。 內切-β-1,4-葡聚糖酶/纖維素酶活力(μg /h/mL)=[(ΔA+0.0545)÷0.0132]÷V1÷T =1515.2×(ΔA+0.0545) V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.05 mL； T---反應時間，60 min=1 小時； W---樣本質量，g； 500---細菌或細胞總數，500 萬； Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒； 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（2mg/mL）：從標準品管中稱量取出 4mg 至一新 EP 管中，再加 2mL 蒸餾水混勻溶解即 2mg/mL 的葡萄糖（母液需在兩天內用且-20℃保存）。 2 把母液用蒸餾水稀釋成六個濃度梯度的標準品：0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2. mg/mL。也可 根據實際樣本來調整標準品濃度。 3 依據對照管的加樣表操作，根據結果即可制作標準曲線。