糖原磷酸化酶b(GPb)試劑盒,微板法

糖原磷酸化酶b(GPb)試劑盒,微板法

糖原磷酸化酶b(GPb)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 

糖原磷酸化酶 b（GPb）試劑盒說明書 

（貨號：WS5650W 微板法 48 樣）

一、產品簡介： 糖原磷酸化酶（Glycogen phosphorylase，GP，EC 2.4.1.1)）是糖原分解代謝的關鍵酶， 使糖原分子從非還原端逐個斷開α-1，4-糖苷鍵移去葡萄糖基，釋放 1-磷酸葡萄糖，直至臨 近糖原分子α-1，6-糖苷鍵分支點前 4 個葡萄糖基處。GP 分為有活性的糖原磷酸化酶 a（GPa） 和無活性的糖原磷酸化酶 b（GPb）兩種形式。GPb 在一定濃度的腺苷酸（5， -AMP）存在 下可被激活。 本試劑盒提供一種快速，靈敏和簡便的檢測方法，GP 催化糖原和無機磷產生葡萄糖殘基 生成糖原和 1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖變位酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化 NADP+還原 成 NADPH，接著與特異顯色劑反應生成有色物質，通過檢測該有色物在 450nm 的增加速率， 進而計算出 GP 酶活性大小。添加一定濃度的腺苷酸（5， -AMP）時測定 GP（GPa 和 GPb） 活性，未添加腺苷酸（5， -AMP）時測定 GPa 活性，GP 活性減去 GPa 活性得到 GPb 活性。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再加 1.1mL 蒸餾水充分溶解備用。 試劑二 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再加 1.1mL 蒸餾水充分溶解備用。 試劑三 粉劑 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再加 1.1mL 蒸餾水充分溶解備用。 試劑四 液體 1mL×1 支 4℃保存 試劑五 液體 15mL×1 瓶 4℃保存 試劑六 粉劑 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再加 1.1mL 蒸餾水充分溶解備用。 標準品 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 若重新做標曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標儀、96 孔板、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、研缽、冰。 四、糖原磷酸化酶 b（GPb）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進行冰浴勻漿。12000rpm 4℃離心 15min，取上 清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取 ② 細胞樣本： 先收集細胞到離心管內，離心后棄上清；取 500 萬細胞加入 1mL 提取液；超聲波破 碎細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；4oC 約 12,000rpm 離心 10min，取上清作為待測樣品。 【注】：若增加樣本量，可按照細菌/細胞數量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進行提取。 2、上機檢測： ① 酶標儀預熱 30min 以上，設置溫度 30℃,調節波長至 450nm。本試劑盒僅供科研使用 2 ② 試劑放在 30℃水浴 5min； ③ 在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 10 10 試劑一 10 試劑二 10 10 試劑三 10 10 試劑四 10 10 試劑五 140 150 混勻，30℃條件下孵育 10min 試劑六 10 10 混勻，30℃條件下，2min 時立即于 450nm 處讀取吸光值 A，△A=A 測定-A 對照（每個樣本需做一個樣本自身對照）。 【注】：1. 若ΔA 過小，可以延長反應時間 T（如：10min 或更長）再讀取 A2，或增加樣本量 V1（如增 至 20μL，則試劑五相應減?。?，重新調整的反應時間 T 和 V1 需代入計算公式重新計算。 2. 若 A 測定值大于 1.5，可縮減反應時間 T（如：1min 或更短）再讀取 A2，或減少樣本量 V1（如 減至 5μL，則試劑五相應增加），重新調整的反應時間 T 和 V1 需代入計算公式重新計算。 五、結果計算： 1、標準曲線方程：y = 0.0838x - 0.0173，x 是標準品摩爾質量：nmol，y 是ΔA。 2、按樣本蛋白濃度計算： 單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘使 1nmol NADP+轉換成 1nmol NADPH 為一個酶活單位。 GPb（nmol/min /mg prot）＝[(ΔA+0.0173) ÷0.0838]÷ (V1×Cpr) ÷T=596.7×(ΔA+0.0173)÷Cpr 3、按樣本鮮重計算： 單位定義：每克組織每分鐘使 1nmol NADP+轉換成 1nmol NADPH 定義為一個酶活單位。 GPb（nmol/min/g 鮮重）＝[(ΔA+0.0173) ÷0.0838]÷(W× V1÷V) ÷T=596.7×(ΔA+0.0173)÷W 4、按細胞數量計算： 單位定義：每 104個細胞每分鐘使 1nmol NADP+轉換成 1nmol NADPH 定義為一個酶活單位。 GPb（nmol/min/104 cell)= [(ΔA+0.0173) ÷0.0838]÷(500×V1÷V)÷T=1.19×(△A+0.0173) V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.01 mL； W---樣本質量，g； T---反應時間，2 min； Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 附：標準曲線制作過程： 1 制備標準品母液（1nmol/μL）：向標準品 EP 管里面加入 0.6mL 蒸餾水（母液需在兩 天內用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個濃度梯度的標準品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. nmol/μL。也可根據實際 樣本來調整標準品濃度。 3 依據加樣表操作，根據結果即可制作標準曲線。